吴中行,字子道,江苏武进人。父亲吴性,哥哥吴可行,都是进士。吴性,官至尚宝丞。吴可行,为检讨。吴中行刚刚二十岁时就中了乡试,吴性告诫他不要急于求进士,于是他没有参加会试。隆庆五年(1571)中进士,选为庶吉士,授职编修。

大学士张居正是吴中行考进士时的主考官。万历五年(1577),张居正的父亲死了,没有解职回乡奔丧,仍就执掌朝政。御史曾士楚、吏科都给事中陈三谟首先上疏奏请让他留下,满朝大臣都随声附和,唯独吴中行很气愤。刚好彗星出现在西南方,长度竟达到天际,皇上下诏让百官反省。吴中行于是首先上疏说:“张居正父子分处两地,双方已有十五年未见面。其父已死于数千里之外,陛下不让他星夜奔丧,抚棺恸哭,却一定要他违心地压抑感情,忍痛含悲于朝廷之上,并让他主持政务,执掌权柄,发扬功业,为国事操劳,这难道合乎情理吗?!张居正每每自言他谨守圣贤的义理和祖宗法度。宰我欲将丧期缩短,孔子说:‘宰我有三年的爱心于他的父母吗?’王子请求服几个月的丧期,孟子说:‘虽然增加一天已经超过了。’圣贤的训导怎么样?在法律上,虽然是老百姓、小官吏,隐匿丧情也是被禁止的,唯有武人得以穿黑色丧服不奔丧事,但这不是处置辅臣的办法。有人说过去也有起用之事,但也没有听说一天都不出京城大门,而立刻就任职的。祖宗的规矩如何呢?这件事关系到万古的纲常,天下的人都会看到、听到,唯有今天没有过失的举动,然后后世才没有令人遗憾的议论。亟待解决的问题莫过于此。”

奏疏已经上了,他把副本告诉张居正。张居正惊讶地说:“奏疏送进去了吗?”吴中行说:“没有送上不敢告诉你。”第二天,赵用贤的疏奏上。第三天,艾穆、沈思孝的奏也呈上。张居正发了火,与冯保商量,欲廷杖他们。翰林院侍讲赵志皋、张位、于慎行、张一柱、田一隽、李长春,修撰习孔教、沈懋学都上奏救他们,但奏疏都被阻止没有上报。学士王锡爵于是会同数十人,找张居正求和解,张不接受。于是廷杖吴中行等四人。第二天,进士邹元标上疏争辩,也被廷杖。这五个人正直的名声震动天下。吴中行、赵用贤并称吴、赵。南京御史朱鸿谟上疏救援五人,也被斥责。吴中行等受了廷杖后,校尉用布将他们拖出长安门,用木板抬着,当天就驱赶出都城。吴中行气息都没有了,中书舍人秦柱带来了医生,喂服了一勺子药,才苏醒。用车载着他南归,归家后,挖出腐肉数十块,大的如手掌,深寸许,一肢都挖空了。

万历九年(1581)全面考核京官,把五人列于考察名单上,将其禁锢不让任职。张居正死后,曾士楚应当巡按苏、松地区,他惭愧地说:“我有什么面目去见吴、赵二位大人呢!”于是声称有病走了。陈三谟已被提为太常少卿,不久与曾士楚都被弹劾而削去职务。朝廷大臣一起推荐吴中行,下诏起用为原官职,升为右中允,值经筵。大学士许国攻击李植、江东之,诋毁吴中行、赵用贤是他们一派的。中行上奏辩白,因而乞求回乡,皇上没有答应,又升为右谕德。御史蔡系周弹劾李植,又提到中行,中行请求免职,上了四道奏章。皇上下诏赏赐白金、文绮,乘驿马回去。后来言官屡屡推荐他,执掌大权的人有意抑制,不召他回京城。过了很久,起用为侍讲学士,执掌南京翰林院。同里之人佥事徐堂吉曾弹劾吴中行,事情已经了结,给事中王嘉谟又重提旧事弹劾他,朝廷命令他呆在家中等待征召。不久就死了。后赠为礼部右侍郎。